绪论

  • Basic steps in gene cloning

    • 将DNA片段插入载体;
    • 导入宿主细胞
    • recombinant molecule 复制
    • 宿主细胞分裂
    • plating产生clony

  • basic steps in PCR:特异引物识别DNA片段从而使其被复制从而富集

    • 94°C 氢键断开, 双链分开
    • 50-60°C, DNA与引物杂交, 退火
    • 74°C, Taq DNA polymerase(抗高温), 引物5’->3’复制
    • 94°C下一轮循环
  • Limitation of PCR:
    • 必须知道退火位点,也即知道引物结合地方序列;
    • 长度限制: 5kb-40kb(特殊技术可以最高复制40kb)
  • usage:
    • virus dectation: 高倍扩增
    • purifying gene

载体

Plasmid

  • 载体要求:
    • 能够在宿主体内复制: 含有复制起点
    • 理想大小小于10kb,大了会断开,而且不易于操作;
  • 宿主细胞:大肠杆菌, 一次只接受一个质粒拷贝;
  • 类型I: plasmids,
    • 环形分子
    • 独立于基因组
    • 携带一个或多个基因
      • 携带抗体基因可作为选择性标签,四环素和青霉素抗性基因;
  • 质粒复制方式:
    • integrative:插入宿主基因组复制
    • non-integrative:含有复制起始位点，独立复制,也称为episome;
  • copy number: 宿主体内独立存在的质粒分子数；
    • stringent:少但是大, 1-2/cell
    • relaxed:多, over 50/cell
  • conjugation:
    • 物理接触
    • 产生pilus(管道?)
    • 宿主DNA滚环复制并转移到受体中
    • conjugative&non-conjugative:产生pilus or not;
      • 由于conjugative plasmid 会传播至其他细胞;
      • tra基因控制(含有则conjugative)
    • compatibility:是否两质粒能共存;
      • incompatiblity:在复制过程中两个子代细胞分别获得一个
  • F plasmid/F factor: 含有tra基因,conjugative;

Bacteriophage(Phage)

  • 噬菌体特征:
    • 侵染细菌
    • 结构简单
    • 含有DNA|RNA:编码复制的基因
    • Capsid:外衣
  • 类型I:λ phage
    • episome
    • 环状和线性DNA之间切换(cos位点)
    • 基因成簇排列
    • 裂解型
    • 感染时间小于20min
    • 基因组大小49kb
  • prophage:整合进基因组的噬菌体DNA;
  • lysogen:携带prophage的宿主;
    • 编码capsid的基因成簇排列
    • 便于控制基因组表达
    • b2 region: 可以删掉以增加能放进capsid的外源DNA长度
  • cos site:sticky end
    • 线性的DNA分子通过两cos位点环化，从宿主基因组脱离
    • 内切酶识别序列，能够将滚环复制得到的长链切断成单个噬菌体基因组
  • 类型II:M13
    • 环状, 但是却是单链DNA
    • 不发生细胞裂解，M13颗粒持续释放
    • capsid由三个基因的多份拷贝(不是多次复制)编码
    • 不发生整合
  • M13复制流程:
    • 单链DNA注入并合成双链，称为RF，复制态
    • 双链DNA 通过滚环复制生成新的RF
    • 双链replicative form(RF)通过滚环机制重新产生单链DNA(滚环但是不复制)
    • 单链DNA环化并组装
  • M13的优势:
    • 基因组小于10kb;
    • RF类似质粒,能够以质粒形式感染;
    • 单链形式DNA有利于测序和体外突变(in vitro mutagenesis);还能用于phage display(将要表达的蛋白基因和衣壳基因连在一起使其位于噬菌体外部)

DNA纯化

  • Terminology:
    • Total cell DNA: genomic DNA加上additional DNA molecules(如质粒)
    • Pure plasmid DNA:从细菌中提取,去除genomic DNA后的;
    • Phage DNA:from bacteriophage particles
      • 需要去除衣壳(M13除外,RF直接na)
    • Defined medium: all the components are known(M9)
    • Undefined medium:the precise identity and quantity of the components are not known(LB)
  • Basic steps:
    • 细菌培养
      • E.coli培养:
        • LB medium
        • 37°C
        • 摇床充气
      • 检测细胞浓度:
        • 光学法:测量在600nm处的吸光度(光密度OD是在特定波长下的吸光度)
        • $1\ OD_{600} = 0.8\times 10^9\ cells/ml$
    • 离心使细胞裂解
    • 细胞抽提(去除除DNA外组分)
      • 物理方法:研磨
      • 化学方法:
        • 溶菌酶:digests the cell wall
        • EDTA: removes magnesium ions
        • sodium dodecyl sulphate (SDS):removes lipid molecules.
        • 离心:remove insoluble debris
      • DNA纯化:
        • 方法1:降解污染物
          • proteinase K处理: 消化蛋白质;
          • 苯酚和氯仿混合(Phenol&chloroform):沉淀蛋白质
          • ribonuclease:去除RNA
        • 方法2:组分分离
          • 离子交换层析:DNA, RNA,部分蛋白质带负电结合与正电树脂,随后盐溶液洗脱,RNA+protein首先脱出,DNA最后,保留;
          • silica method:
            • guanidinium thiocyanate硫氰酸胍：将除DNA外的物质变性, 同时使得DNA结合于silica particles;
      • DNA富集:
        • Ethanol precipitation:$Na^+$, -20°C条件
          1. 玻璃棒搅动附着DNA
          2. 离心沉淀DNA
        • DNA浓度: 测量在260nm波长时的吸光度
          • $1 \ OD_{260} = 50\ ug/ml$
        • DNA纯度:
          • The ratio of the absorbances at 260 and 280 nm
          • around 1.8 with a pure DNA sample.
  • 分离质粒和细菌基因组:
    • 物理性质:
      • 质粒DNA分子较小, 细菌基因组较大
      • 质粒和细菌基因组都为环状,但是在细胞抽提时基因组会断裂成线性分子,所以我们要做的是分离环状DNA分子;
    • 质粒DNA双链的两种形式:
        • Covalently closed circular (ccc) DNA (Supercoiled DNA)
        • Open-circular (oc) DNA
      • 超螺旋分子能很轻易地从非超螺旋分子中分离,且大多数质粒以超螺旋形式存在于细胞中;
        • alkaline denaturation:碱变性法
        • 线性DNA在高PH时变性双链分开,而超螺旋质粒则保持原样;
        • 再将PH调回7,DNA分子复性,但交织在一起,通过离心被去除;
        • 这一过程大部分RNA和蛋白质也变得不溶, 被离心去除;
      • 氯化铯密度梯度离心:
        • 密度不同，导致蛋白质(浮力小)在管的顶部，而RNA则相反在底部,DNA的浮力密度在蛋白质与RNA之间故而在管中间;
        • EtBr处理:分离超螺旋DNA和其他DNA
          • EtBr通过插入相邻碱基对与DNA结合，导致双螺旋部分解开。
          • 超螺旋不易结合故而浮力密度减少较少,而线性分子减少较多;

  • 质粒扩增:

    • 多拷贝质粒能够在没有蛋白质合成的情况下复制
      • 氯霉素, 蛋白质合成抑制;

  • λ噬菌体DNA获取:

    • 获取噬菌体颗粒: 侵染后离心后噬菌体颗粒在清液层,而细菌沉积;
      • 噬菌体分为烈性噬菌体和溶原性噬菌体;
        • 在感染于寄主细菌细胞时，前者往往在菌体内增殖并将菌体裂解；
        • 后者则不使细菌裂解，而成为与细胞同步增殖的遗传因子——原噬菌体。
        • 温和噬菌体的基因组整合于宿主菌基因中，这种整合在细菌染色体上的噬菌体基因称为原噬菌体，原噬菌体可随细菌染色体的复制而复制，并通过细菌的分裂传给下一代，不引起细菌裂解，这种带有原噬菌体的细菌称为溶原性细菌。
      • lysogenic型λ噬菌体获取:
        • cI基因:控制噬菌体处于prophage状态;
          • 在cI内引入一个温度敏感突变(temperature-sensitive,即cIts)
            • 30°C:正常分裂;
            • 42°C:裂解;
      • non-lysogenic型λ噬菌体获取:
        • 许多载体都删除了cI基因,无法整合入细菌基因组;
        • 所以只能通过细胞裂解获得噬菌体,故而需要注意噬菌体与细菌的比例;
    • 富集噬菌体颗粒:
      • PEG,一种长链多聚化合物,在有盐的条件下能够让噬菌体颗粒沉淀;
        • 能够有效减少悬液的体积,有助于DNA提取;
    • 噬菌体颗粒提纯:氯化铯密度梯度离心;
      • 去除细菌残骸,DNA;
    • DNA提取:只要去除蛋白外壳即可,苯酚或者蛋白酶处理;
  • M13噬菌体DNA获取:
    • Replicative form形式同质粒一样获取;
    • 单链DNA形式获取:
      • 类似λ烈性菌;

Manipulation of Purified DNA

  • DNA外切酶:
    • 直接移除双链末端碱基对;
    • 移除双链中一条单链的末端核苷酸;
  • DNA内切酶:
      1. 只能切开单链，或者双链中裸露的单链;
      2. 既可以切单链也可以切双链;
      3. 在特异性位点切割双链;

  • DNA连接酶:

      1. 连接双链中的单链断开
      2. 连接两双链分子

  • DNA聚合酶:

    • 需要有双链区(primer)起始聚合;
    • DNA聚合酶I
      • 5’-3’外切酶活性由一个323氨基酸片段决定，失去这一片段不影响聚合酶功能，但是无法解聚DNA, 缺失该片段后的酶,叫做Klenow fragment;(注意是这个修改后的酶!!!)
        • 修复功能通过替换旧链方式实现，当5’-3’外切酶功能失去后，只能填充缺口，无法切除确实部分;
        • 注意5’-3’外切酶,缺口处理方向;
    • Taq DNA polymerase:
      • 耐高温的嗜热菌DNA聚合酶I
  • DNA modifying enzymes
      1. 去除5‘端末端磷酸基团
      2. 重新在5’端接上磷酸基团
      3. 将脱氧核苷酸加到DNA链(单双)3‘末端(OH基团)
  • 限制性内切酶:
    • Host-controlled restriction:宿主细胞能够在噬菌体复制之前切割噬菌体DNA,而细菌自身的DNA受到保护，不会被降解，因为它被甲基修饰。
    • II型限制性内切酶在基因克隆中很重要。
      • 识别位点为回文序列；
      • II限制性内切酶有相同的亚基，识别的序列必然相同；
      • 两亚基位置不平行，故而结合位置有差异, 所以产生粘性末端;
      • BamHI和BglII具有相同的粘性末端;
      • 还需要注意的是切割出的粘性末端长度:
        • 如EcoRI,切割”G|AATTC”,但是由于对称结构,左右两边各留出一个核苷酸,粘性末端为”AATT”
  • restriction digest:
      • Ethidium bromide (EtBr):前面说到能够插入DNA双链,同时也能用来给DNA染色;
    • DNA分子大小评估:
        • a size marker;
      • 使用不同的酶切割获取不同的基因;
  • DNA ligation:
    • 互补粘性末端的连接比钝性末端要高效的多;
    • Putting sticky ends onto a blunt-ended molecule:
      • Linkers
          • There should not be any BamHI recognition site in the fragment!
      • Adaptors
        • 实际上是带有粘性末端的片段;
        • Part c是可能的问题:adaptor相互连接;
          • 解决办法:将粘性末端突出链(5’端)的磷酸基团去除,从而无法互相结合
      • Producing sticky ends by homopolymer tailing
        • Terminal deoxynucleotidyl transferase:末端转移酶,见上文 DNA modifying enzymes;能够往3’端添加核苷酸;
          • 目的基因加poly C,载体加poly G,结合稳定;
          • polymer长度不同的问题: Klenow polymerase+ligase

Introduction of DNA into Living cells

    • 未连接的载体
    • 未连接的DNA
    • 自体连接的载体
    • 携带错误片段的分子

  • [质粒DNA引入]Transformation:the introduction of any DNA molecule into any living cell.

    • 只有少部分物种能够轻松转化;
    • 大肠杆菌只吸收少量DNA;
    • 大肠杆菌需要化学或者物理处理使得其competent;
      • competent: DNA吸收能力增强的细菌培养物;
    • Competent treatment:
      1. calcium chloride($CaCl_2$)溶液,低温处理;
        • 氯化钙能使DNA沉积于细胞表面;
        • 同时造成细胞膜产生物理变化(如打出孔)
      2. 将温度提升到42°C,使得DNA被吸收
      3. 检测是否吸收完成|稳定:通过判断某些基因是否表达(如表达青霉素抗性的基因)
    • Select transformed cells:
      • 1 ng pUC8质粒只能够产生100-10000个转化体, 仅为总DNA分子数的0.01%,故而要经过挑选;
      • 抗生素选择:
          • 用共有抗性 amp 筛选出载体分子和重组分子(不含载体的被筛去);
          • 需要37°C培养1小时以让抗性基因表达;
      • Recombinant identification
        • 插入失活:正常表达的载体含有的选择性标签由于目的基因的插入而失活;
          • 插入后原本表达的特征不表达;
        • 抗生素抗性基因选择(pBR22):
          • pBR22携带四环素和青霉素抗性[BamHI插入]
          • 用木板记录下菌落位置,并按位置移植到$tet^R$培养基中,重组分子由于插入失活从而无法生长, 在第一个中取反即可得知重组分子菌落位置;
        • lac基因选择(pUC8):
          • pUC8携带青霉素抗性基因[BamHI插入]
            • 半乳糖苷酶由两部分组成:一部分由宿主编码(编辑过的大肠杆菌,缺失了编码lacZ’的部分),另一部分由质粒表达,组合成全酶;
            • X-gal:乳糖类似物,被半乳糖苷酶分解生成深蓝色产物;

            • IPTG: 在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录启动。当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经β-半乳糖苷酶催化，转变为异乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的作用与异乳糖相同，是一 种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。

            • 由于recombinants中的lac基因被插入失活,故而无法合成半乳糖苷酶片段,无法分解X-gal,呈现白色;
  • [噬菌体DNA引入]transfection&in vitro packaging:
    • transfection: equivalent to transformation;
      • M13双链的RF形式DNA导入
    • in vitro packaging:
      • λ噬菌体转染效率低,使用in vitro packaging方法;
      • capsid 蛋白准备:
          • 系统1: 缺陷cos位点,cos位点无法被识别, 致使λ噬菌体无法复制(滚环需要环状DNA),但是能够合成蛋白;
          • 系统2:有两个重组, 两个所携带capsid基因中分别有一个突变,生成的蛋白不全,故而无法独立完成感染循环,将之混合后能够进行组装从而获得噬菌体.
    • 噬菌斑:
        • 对于λ噬菌体:包含裂解的宿主细胞和噬菌体颗粒;
        • 对于M13:包含生长缓慢的细菌和M13颗粒;
      • 每个噬菌斑来自于单个感染的细胞;
      • 可能是recombinants,也可能是self-ligated vectors;
    • Select recombinant phages:
      • lac基因插入失活:recombinant的噬菌斑不是white,而是clear!
      • λ cI基因插入失活:non-recombinant的cI基因正常工作,形成lysogen,故而呈现浑浊噬菌斑;
      • Spi表型:λ噬菌体不能感染P2噬菌体已经感染的大肠杆菌,称之为$Spi^+$;
        • 插入新的DNA能够使λ转变为$Spi^-$,从而能够形成噬菌斑[也只有重组型可以];

Cloning Vectors for E.coli

  • 经典质粒:
    • pBR322
      • 4363bp大小,体积小;
      • 青霉素和四环素抗性基因;
      • 15copies, 高拷贝数;
    • pBR327
      • 比pBR22更高的拷贝数(30-45copies)
    • pUC8
      • 500-700copies;
      • 青霉素抗性基因+lac’基因,能够完成重组体选择
      • lac’基因上有一簇限制性位点,允许DNA片段两不同粘性末端;
    • pGEN3Z
      • 青霉素抗性基因+lac’基因
      • 含有两promoter序列在lac’基因的两端,可以用于体外转录,从而允许双向转录;
  • 噬菌体载体:
    • lambda噬菌体:
      • 大小问题: 噬菌体衣壳大小有限,能放入的DNA长度有限;
        • solution: 将无重要功能的b2区去除从而省出空间;
      • 酶切位点问题:λ噬菌体有多个酶切位点(甚至对于同一个限制酶);
        • solution: 将分泌限制酶的E.coli突变体用λ噬菌体感染,如果只有产生突变的,去除了限制位点的噬菌体能形成噬菌斑;
        • 绝大部分的λDNA被降解, 少数剩下的(产生plaque)丢失了限制位点;
      • 种类:
        • λ insertion vector:去除b2区得到,存在一个酶切位点;
          • 普通λ基因组只能增加5%的DNA,也即3kb,否则放不进capsid,去除非必要区后,容量大大增加;
          • λgt10:CI基因能够保持基因组在Prophage状态,含有EcoRI限制位点, 基因插入失活,从而产生clear plaque;携带8kb
          • λ ZAPII:含有lacZ’基因,故而能够允许插入失活,并含有6个限制性位点;
        • replacemnet vector替换型载体: 含有一个stuffer区, 能够通过限制性位点替换掉Stuffer fragment;携带10kb;
    • λ噬菌体既可以用环状DNA以质粒形式转染,也可以使用liner形式(含有EcoRI和cos位点)
      • cosmid : a plasmid that carries a cos site;
  • 所需的克隆数:N
    • $\rho$ = 在基因文库中gene of interest出现的概率;
    • $a$ = 插入片段的大小
    • $b$ = 基因组总大小;
  • M13噬菌体:
    • 由于M13基因组基因相隔很近, 修改或者是删除这些基因将会导致RF的功能受阻,只有508个碱基的修改不会影响, 也即是复制起始位点所在区;
    • 插入lacZ’到起始位点后面的流程:
      • 怎么做到将限制性位点插入lacZ’?
        • 首先利用密码子的简并性, 突变得到EcoRI位点同时不改变lacZ’的功能;
        • 接着将两端有EcoRI粘性末端的polylinker(携带多个限制位点)插入lacZ’的限制位点;
    • Hybrid plasmid-M13 vectors (phagemids):杂交M13和质粒:
      • 将M13的一部分DNA(形成RF的基因)导入pUC8从而使得质粒能像M13一样进行;

Cloning vectors for Eukaryotes

  • 出于某些特殊目的, 我们可能需要使用真核生物作为宿主:
    • 为了获得大量药用蛋白;
    • 为了改变某个生物的性质,如为农作物添加除草剂抗性;
  • 真菌载体(酵母):
    • 2 μm plasmid:
      • REP1 and REP2 are involved in replication of the plasmid.
      • FLP: 编码能够使质粒内重组的蛋白;
      • copy numbers:70-200
    • selective marker:
      • LEU2: 编码将丙酮酸转化为亮氨酸的酶, 对于trp-营养缺陷型的宿主来说是必要的,故而以之作为宿主,再使用含LEU2的载体从而得到recombinant;
      • 其他的marker也类似,主要是使用缺陷型;
    • 克隆载体:
      • 种类:
        • Yeast episomal plasmids (YEps):
          • 为shuttle vector, 能够同时在酵母和大肠杆菌中复制;
            • 这一性质使得其能首先通过大肠杆菌进行纯化, 再转入酵母;
          • 载体通过与宿主基因组中同源的基因发生重组从而整合进基因组:
            • LEU突变体和酵母LEU基因发生重组.使得质粒进入酵母基因组,类似插入序列,会复制目标片段,形成两个基因,但通常只有一个有效
        • Yeast integrative plasmids (YIps)
          • 跟episome的区别在于没有起始位点,只能通过整合进基因组和宿主一起复制;
        • Yeast replicative plasmids (YRps)
          • 跟integrative相对, 以质粒形式复制;
        • Yeast centromere plasmids (YCps)
          • 含有复制区和着丝粒,能够像基因组一样复制,故而被称为mini-chromosome;
      • 几种克隆载体比较:
        • 转化频率:
          • 加入一定量质粒DNA能获得的转化体数(个每微克)
          • YEps > YRps,YCps >> YIps
        • 拷贝数:
          • YEps:20-50
          • YRps:5-100
          • YIps == YCps == 1
        • 重组体稳定性: YIps > YCps > YEps > YRps
      • 特殊载体:YAC yeast artificial chromosome
        • 组成成分:
          • centromere: 能够像基因组一样复制
          • two telomeres:
            • 作用1: 让末端能够正确地被复制;
            • 作用2: 避免其被外切酶消化;
          • 复制起点;
          • TEL: act as seeding sequences for telomeres building
          • CEN4: DNA from the centromere region of chromosome
          • ori: The origins of replication
          • SUP4: selectable marker into which new DNA is inserted. Yeast are normally red(accumulation of red pigment), and those transformed with YAC will form colorless colonies.
          • URA3 and TRP1: selectable markers.
        • Electroporation:
          • 电穿孔法:在膜上打出暂时的孔洞从而吸收DNA, 对于植物来说则是要多加两步, 去细胞壁和重新生成细胞壁;
  • 对于植物:
    • Ti(tumor inducing) plasmid:
      • Ti质粒转染后T-DNA会整合进基因组,从而使细胞表现出成瘤性
      • Ti质粒过大, 不利于操作:
        • 解决方法1: 双质粒法, 将T-DNA从原来的Ti质粒移出至质粒B,剩下质粒A;
          • 质粒A负责表达转移T-DNA的蛋白;
          • 质粒B则小到便于我们操作,从而能够添加限制位点;
        • 解决方法2:共整合法,Ti质粒加上一个携带有T-DNA同源片段的质粒(含目的基因)
          • T-DNA和小质粒发生同源重组,从而将目的基因转移到T-DNA中;
      • T-DNA整合的机理:
    • 质粒载体直接转移:
      • 超螺旋质粒能够通过同源重组整合进植物基因组;
      • 导入细胞的方法: Biolistics,PEG-induced DNA delivery,Electroporation
    • 将基因导入叶绿体基因组:
      • 通过同源重组导入, 叶绿体数量多,表达量高;
    • 植物病毒载体:
      • 植物病毒多为RNA,仅有的两种DNA病毒不适合作为克隆载体;
  • 动物克隆载体:
    • 部分蛋白在细菌或者真菌中无法正常表达;基因疗法,通过将一个基因导入病人细胞;
    • P elements: