蛋白质组学学习笔记

第一章—蛋白质组学绪论

蛋白质组学的必要性
- You can have a protein in the cell when its mRNA is no longer present
- You can have lots of mRNA without translation of the message to protein
- No good correlation between mRNA abundance and protein amount in a cell at a given time.
从mRNA水平不一定能预测细胞中相应蛋白质的水平。
- 各种mRNA不同的稳定性和不同的翻译效率
- 蛋白质形成后在稳定性和转换速度上有很大不同。
- mRNA水平没有告诉我们相应蛋白质的调节状态，蛋白质的活性和功能常有一些内源翻译后的改变，也会因环境因素而改变
  - 翻译后的多种修饰
  - 蛋白质易受损伤
  - 蛋白质修饰引发蛋白质降解
蛋白质白质表达水平变化极大
- 基因的转录速度
- mRNA的翻译效率
- 细胞中蛋白质的降解速度
含有不常使用的某些基因倾向于较低水平表达。
针对生命活动中某一种或某几种蛋白质，难以形成一种整体观，难以系统透彻地阐释生命活动的基本机制。

基因组与转录组不能取代蛋白质组
- 基因和蛋白质并不存在严格的线性关系
- ORF并不预示一定存在相对应的功能性基因
- mRNA水平并非与蛋白质的表达水平对应
- 翻译后修饰及同工蛋白质(Isoforms)等现象在基因水平无从表现
- 蛋白质与蛋白质的相互作用
蛋白质组学与蛋白质化学
- 后者同一时间内只研究一个蛋白质或多亚基蛋白质复合物。研究工作通常包括完整序列测定、结构测定以及结构控制功能的模型研究
- 前者需要获得体系内所有蛋白质组分的物理、化学及生物学参数，如分子量、等电点、表达量等。是在数据库匹配工具帮助下进行部分序列测定。

蛋白质组学所遇到的挑战
- 蛋白组学实验中, 往往只能检测到一小部分蛋白质
- 需要被研究物种的全基因组序列
- 无法进行大规模蛋白分析
  - 蛋白质易降解
  - 存在很多同工体
  - 没有蛋白质的克隆手段
- 数据分析
  - 数据存在噪声, 难以分离真实信号, 导致搜索耗费资源
  - 数据库匹配只能给出可信度得分, 需要人为干涉消除假阳性
- 生物医学瓶颈
  - 只能获得疾病某一时刻的状态, 无法追踪其真实进程

第二章—蛋白质样品的制备

蛋白质的提取: 收集样品+破碎+抽提

样品收集: 要控制稳定的材料来源
- 注意因素
  - 生长时期
  - 组织位置
  - 可溶性
  - 蛋白质组的修饰
- 材料存储, 上中下三策, 解冻时要越快越好，但避免局部过热
  - 优先直接用, 立即抽提
  - 先以液氮处理后於 -70℃则更佳
  - 在采集后，尽速置於 -20℃
- 制备样品
  - 待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白）
  - 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀
  - 防止发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）
  - 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白
  - 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白
破碎细胞: 分泌性蛋白质，多散布在材料中，只要研磨均匀，大多可抽取得到。不能研磨过度，以免细胞破得太碎。
- 液态氮研磨：以研钵打碎材料後研磨成粉。
- 均质器：玻璃等材质，较温和的研磨方法。
  - 把材料先切成碎片才容易进行抽取。材料亦可以液氮急速冷却
- 玻璃球 (glass bead)：以很细的玻璃球混在样本中，用力振荡
- 酶解
- 洗涤剂裂解
- 冻融
- 渗透裂解
- 超音波震荡 (ultrasonication)：以超音波打破细胞，多用在微生物材料。
细胞裂解: 保持低温（冰浴，使用预冷的溶液）,直接加入含强变性剂的裂解液
- 目标:
  - 必须打断non-covalent protein-protein, protein-DNA, protein-lipid interactions, disrupt S-S bonds
  - 必须阻止蛋白裂解;
    - 避免蛋白水解和降解的措施
      - 保持低温
      - 变性剂
      - 蛋白酶抑制剂
- 裂解液主要成分
  - 还原剂：用于还原二硫键或防止蛋白质氧化
    - DTT : 含有自由巯基，带电荷，IEF过程中降低溶解度 (抗氧化剂)
    - TBP: 不带电荷，增强IEF过程中蛋白溶解度，提高一维向二维转移效率
  - 缓冲液
    - NaN3:除菌
    - EDTA: 除二价离子
    - 蛋白酶抑制剂
  - 酶：用于消化污染的核酸、糖和脂类
  - 变性剂: 改变溶液离子强度和PH，破坏蛋白质-蛋白质相互作用,破坏蛋白质的二级结构和三级结构。
    - 尿素－硫脲混合物提高样品溶解度, 硫脲水溶性差，只有在浓尿素溶液中可溶性才好
  - 去污剂：有助于溶解膜蛋白质，并有助于膜蛋白质与脂类的分离
    - SDS：阴离子去污剂，能破坏大多数非共价结合的蛋白; 破坏IEF，所以只用于前期溶解，然后用非离子或两性离子去污剂置换出来。
    - CHAPS：两性离子去污剂，对膜蛋白溶解有效
- 非蛋白物质的去除
  - 核酸：超声（防止产生泡沫）和核酸酶（产生假点）
  - 脂与多糖：超速离心（部分损失）
  - 盐：小分子，浓度过高会降低等电聚焦的电压
    - 透析（时间长），凝胶过滤，沉淀重悬法（部分损失）
蛋白质浓缩:
- 盐析及沉淀法: 蛋白质在水溶液中的溶解度，会因溶液中其它盐类浓度的改变而增減
- 硫酸铵 (ammonium sulfate)
  - 硫酸铵是中性盐，对蛋白质有相当好的安定作用。
  - 又因为其离子容积较大，吸走水分子的能力也大，成为有效的盐析工具。
- 有机溶剂沉淀法
  - 因稀释水浓度而降低水活性，则蛋白质上亲水性区域的水合度降低，开始聚集在一起，产生沉淀。
  - 使用有机溶剂, 先把温度降至零度左右，缓缓加到蛋白质溶液中，边搅拌使生沉淀。
  - 以离心收集，以增加回收，并可去除丙酮。蛋白质沉淀可凉干，或在布氏漏斗中以少量乙醚洗过制成粉末；
- 顺序抽提法
蛋白质的分离纯化
- 目标:
  - 高活性: 纯化成品与原始粗抽液二者间，其比活性之比值（纯化倍率）越高越好。
  - 高回收率：一般指总活性的回收
  - 高纯度：相对而言，在电泳上看不到其它杂质，即可视为均质。
  - 方便与快速:
  - 经济
- 要求:
  - 高分辨率
  - 高通量
  - 与质谱的下游分析兼容
- 可用于分离的性质:
  - 分子大小:
    - 透析（dialysis）和超过滤（加压或离心）
      - 截留分子量 (MWCO): 一种超滤膜对大小已知的分子化合物的截留性质
        
        对于大于截留分子量的分子，通过超滤膜可以有90 / 95 %的截留效率
        
        可以在温和条件下进行,没有大的生物活性的损失
    - 密度梯度（区带）离心
      - 每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时,即停止不前,最后各种蛋白质在离心管中被分离成各自独立的区带(zone)。
      - 降系数即用来描述此沉降性质；单位为 S (Svedberg unit)。
    - 凝胶过滤法: 不改变样品的生物学性质
      - 又称凝胶层析Gel chromatography、分子筛层析moleculer chromatography或排阻层析ellusion chromatography 。
      - 凝胶条件:
        
        化学惰性
        
        没有或只有极少量的离子交换基团
        
        有足够的机械强度。
      - 凝胶的交联度或孔度（网孔大小）决定了凝胶的分级分离范围: 对大分子物质的分离，多采用琼脂糖。对小分子物质的分离，多采用葡聚糖。
      - 依次洗脱收集后，通过紫外吸收法测定吸收峰。
  - 溶解度
    - 等电点沉淀和PH值控制
      - 当pH = pI，净电荷为零，相邻蛋白质分子之间失去了静电斥力而趋向于聚集沉淀。
      - 不同的蛋白质等电点不同，因此可以通过控制溶液的PH值来沉淀混合物中的某种蛋白成分。
      - 蛋白质可以保持天然构象，能重新溶解于一定浓度的溶液中。
    - 蛋白质的盐析
      - 当溶液中的离子强度达到一定的数值时（盐浓度高达一定数值时），蛋白质的溶解度开始下降，很多蛋白质可以从水溶液中析出，这种现象称为盐析。
    - 有机溶剂分级分离法
      - 有机溶剂的加入改变了介质的介电常数。
      - 这些有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴随着变性。
    - 改变温度
      - 一般蛋白质的分级分离操作一般都在0~4oC温度下进行。
      - 0~40oC之间：大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加，
  - 电荷
    - 离子交换层析
      - 阳离子交换型树脂: 与树脂中的带电基团相互作用，结果X与Na＋交换（阳离子交换），形成SO3-X
      - 在样品与树脂充分交换后，可通过提高流动相中的盐浓度，或改变流动相的pH，或是同时采用这两种方法进行逐一洗脱
    - 电泳
      - 等电聚焦或称电聚焦: 高分辨率的蛋白质分离技术, 也可用于蛋白质等电点的测定
        
        在具有pH梯度的介质（如浓蔗糖溶液）中, 在外电场作用下, 各种蛋白质将移向并聚焦（停留）在等于其等电点的pH梯度处，并形成一个很窄的区带。
        
        pH梯度制作: 预电泳, 利用缓冲液在电场作用下在凝胶内沿电场方向制造一个pH梯度。
        
        只要它们的pI有0.02（甚至<0.02）pH单位的差别就能分开。
  - 吸附性质
    - 硅胶,氧化铝和活性炭等.主要用来分离非离子、水不溶性化合物
  - 对配体分子的生物学亲和力
    - 利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力, 即生物学亲和力
      - 经常只需一步处理即可将某种所需蛋白质从复杂混合物中分离出来，纯度相当高。
2D Gel Electrophoresis
- 过程:
  - 第一向：等电聚焦电泳(SDS破坏电荷条件), 水平方向, PH从大到小
    - very high voltages (5000V)
    - a long period of time (10h)
    - Presence of a pH gradient
    - pH gradient and electric field strength决定分辨率
    - IPG等电聚焦优点
      - pH梯度稳定；
      - 可以生成任意的适当的pH梯度用于不同目的的分离
        
        非线形梯度胶条也可以在特定pH范围使蛋白质分布更均匀
      - 上样量大，可达几十毫克
        
        胶越长, 上样量越大, 分辨率越高; 快速筛选或高丰度蛋白质则用短胶条
      - 重复性好；
      - 强度好，易操作。
  - 第二向：SDS-PAGE, 垂直方向, 分子量从大到小
    - modest voltages (200V)
    - shorter period of time (2h)
    - Presence of SDS
    - %acrylamide & electric field strength, 丙烯酰胺含量和电场强度决定分辨率
      - 丙烯酰胺含量越高, 带跑的越近, 尽量让要研究的带在中间位置
- 效果:
  - 0.0025 pH units精度
  - 能够获得蛋白相对丰度(染色强度)
  - 通过比较能够获得差异蛋白
  - 能够发现新的蛋白
- 缺点:
  - Cannot handle extremely acidic / basic proteins 超出PH梯度范围的无法处理
  - Misses some large proteins (>150 kD )& membrane proteins (>30% of all proteins)
  - Only detects high abundance proteins (top 30% typically)
    - 低丰度蛋白的分离: 将总蛋白组分成蛋白质组亚群，再用pH梯度小于2个pH单位的IPG胶进行窄pH范围的分离。
  - 耗时长

第三章—Strategies for protein Identification and Quantification

两大鉴定方法, 爱德曼降解法和质谱
Edman degradation:
- phenyl isothiocyanate(硫氢酸苯): labeling the N-terminal amino acid

蛋白质组学学习笔记

第一章—蛋白质组学绪论

第二章—蛋白质样品的制备

蛋白质的提取: 收集样品+破碎+抽提

第三章—Strategies for protein Identification and Quantification

第四章—蛋白质相互作用检测技术

第五章—蛋白质生物信息学